Nachdem Mayo im Jahre 1888 sein Medizin-Studium an der Feinberg School of Medicine der Northwestern University in Chicago erfolgreich beendet hat, beginnt er in der Praxis seines Vaters William Worrall Mayo und Bruders William James Mayo mitzuarbeiten. Durch Lehraufhalte in den USA und Europa und die Mitarbeit bei seinem Vater eignet sich Mayo schon früh aktuelle und für den Stand der Zeit sehr fortschrittliche Behandlungsmethoden an. Die Praxis bauen die Mayos weiter aus und eröffneten im Oktober 1889 das „St. Mary´s Hospital“, das erste Krankenhaus des südlichen Minnesotas. Durch die neuartigen Behandlungsmethoden wächst die Mayo Clinic, wie sie später genannt wird, bis zur Jahrhundertwende immer weiter und gilt bis heute als eine der bedeutensten Klinken der Welt. Charles Horace Mayo spezialisiert sich in der Folgezeit auf Schilddrüsen- und Augenkrankheiten sowie Krankheiten des Nervensystems. 1915 gründet Charles Horace vier Jahre nach dem Tod seines Vaters zusammen mit seinem Bruder die Mayo Foundation for Medical Education and Research.